武汉赛科成科技有限公司

间充质干细胞（MSCs）是一种多能干细胞，可从多种组织来源中分离得到，最常见的为骨髓、脂肪组织和脐带。MSCs具有自我更新能力，并可被诱导分化为脂肪、软骨、骨、肝、肌腱和心肌等多种类型的细胞。MSCs可通过抑制T细胞和淋巴细胞增殖等机制调节免疫反应^{[1, 2]}。此外，MSCs还具有抗氧化、抗凋亡、抗纤维化和促血管生成的特性^[8]。因此，MSCs在免疫调节和组织再生方面具有显著的临床潜力。事实上，MSCs已在许多临床试验中用于免疫介导疾病和组织损伤的治疗。已使用MSCs治疗的疾病包括肝病、周围神经损伤、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、糖尿病和心脏病^{[3, 4]}。2024年12月18日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准Ryoncil（remestemcel-L-rknd）上市，这是一种异体间充质基细胞疗法（mesenchymal stromal cell，MSC），用于治疗对类固醇无反应的急性移植物抗宿主病（SR-aGVHD），适用于年龄为2个月及以上的儿科患者。

临床需求

MSCs在治疗应用中的一个关键限制是其在所有组织中的数量都很少，且分离得到的MSCs数量不足以满足临床需求。通常给予患者的剂量为^{2 × 106 cells/kg}体重^{[1, 2]}。对于某些患者和疾病，为达到所需的治疗效果，需要多次给予多达数亿个MSCs^{[5, 6]}。虽然传统的细胞培养皿和培养瓶在体外扩增MSCs，也可以获得实验级别足够细胞数量，但对于临床用途而言远远不够。如使用细胞培养瓶进行大规模细胞扩增时，需要更多的人力和培养空间。此外，使用细胞培养瓶进行大规模扩增不仅效率低下，而且还会影响细胞质量，因为长期在体外扩增的MSCs可能会失去其干细胞特性^[7]。既往研究还报告称，当MSCs达到较高的传代次数时，其增殖和分化潜力会降低^[8]。因此，确定一种有效的大规模扩增技术对于在短时间内以具有成本效益的方式获得大量细胞，同时不损害细胞质量而言至关重要。

常见规模化扩增工艺  

目前MSCs的大规模扩增主要有4种策略，即多层细胞工厂、转瓶（spinner）、滚瓶（roller bottle）和生物反应器。四种方法各有优劣。

*本文中的2D培养指细胞贴附在培养容器表面培养，3D培养指在多孔微载体上培养，而在实心微载体表面培养则被认为是介于2D和3D之间。

工艺选择的主要考量点  

✦ 生产效率和成本：转瓶和滚瓶可以被视作简化版的迷你生物反应器，但和多层细胞工厂一样，都需要大量的人工操作，而且比细胞工厂占用更多的场地。生物反应器则能实现自动化3D培养，占据的车间面积大大减少。

✦ 生产效率和成本：转瓶和滚瓶可以被视作简化版的迷你生物反应器，但和多层细胞工厂一样，都需要大量的人工操作，而且比细胞工厂占用更多的场地。生物反应器则能实现自动化3D培养，占据的车间面积大大减少。

✦ 规模和难度：较小的培养容器仅适合于扩增自体回输用MSCs，而不足以满足每批生产可产生多人份的异体治疗剂量需求。生物反应器因其可控的培养环境，更利于大规模MSCs的扩增，而不会影响细胞活力、表面标记物表达和分化潜力。但操作起来技术门槛较高，需要技术人员具备一定经验。

✦ ^{表面marker：生物反应器扩增后CD105的阳性表达率降至95%以下（BM-MSCs为88%，AT-MSCs为92%）[9]。其他几项研究也报道了使用生物反应器和转瓶扩增的MSCs上CD90和CD105的表达减少[10,11]。作者推测，这可能是由于剪切力或消化过程引起的细胞损伤。据报道，与CD105+ MSCs相比，CD105- MSCs更容易分化为脂肪细胞和骨细胞，并且更有效地抑制CD4+ T细胞的增殖，但心脏再生潜力却更差。CD90- MSCs与较弱的免疫抑制活性和增强的成骨和脂肪基因分化有关[12,13]。因此，在生物反应器和转瓶扩增后CD90和CD105表达的缺失可能会增强MSCs治疗癌症某些疾病的效力。}

✦ ^{扩增倍数：根据Hassan等人的统计分析，目前所报道的生物反应器和细胞工厂的扩增倍数要比转瓶和滚瓶要高。对于细胞工厂，不同研究的扩增倍数比差异很大，一些研究报告的扩增倍数低于20倍，但有少数研究报告的扩增倍数超过100倍，可能是种子初始密度较低所致[1]。}

                                                            使用不同的生物工艺获得的扩增率^[14]。

赛科成MSCs大规模培养方案:

赛科成在贴壁细胞培养方面有多年经验积累，在内部测试及客户现场均获得了良好的结果。市面上微载体一般分为可降解与不可降解两种。针对这两种不同工艺，赛科成均有对应的全套解决方案。

                                                                                   使用微载体培养MSCs

工艺路线1：适用于可降解型球状微载体  

细胞可降解型球状微载体表面及孔洞内部进行，是一种更接近于天然组织中3D培养的模式。对MSCs进行扩增，可以配合赛科成玻璃罐体反应器或一次性搅拌式反应器进行扩增，在反应器内完成细胞的贴壁、培养和微载体酶解步骤，并支持逐级放大，最多可以放大至三级，单批次生产百亿量级MSCs。

工艺路线2：适用于不可降解型2D微载体  

MSCs在不降解型2D微载体表面进行扩增，是一种介于2D和3D之间的培养方式，扩增完成后需要用重组胰酶等消化液进行消化，才能进行细胞的收获或进一步放大培养。可以配合赛科成玻璃罐体反应器或一次性搅拌式反应器进行扩增，在反应器内完成细胞的贴壁和培养，然后转移到专有的微载体消化清洗罐内进行消化和清洗。同样支持逐级放大，最多可以放大至三级，单批次生产百亿量级MSCs。

赛科成生物反应器

赛科成有多种型号规格的生物反应器，并可以提供相应技术方案，支持MSCs培养中培养基、微载体的筛选及工艺优化，小试至大规模扩增工艺全流程。

参考文献：

[1] Usha, Nekanti, and, Lipsa, Mohanty, & and, et al. (2010). Optimization and scale-up of wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells for clinical applications. Stem Cell Research.

[2]  Caruso, S. R. , Orellana, M. D. , Mizukami, A. , Fernandes, T. R. , Fontes, A. M. , & Suazo, C. A. T. , et al. (2014). Growth and functional harvesting of human mesenchymal stromal cells cultured on a microcarrier‐based system. Biotechnology Progress, 30(4), 889-895.

[3] Watson, N. , Divers, R. , Kedar, R. , Mehindru, A. , Mehindru, A. , & Borlongan, M. C. , et al. (2015). Discarded wharton jelly of the human umbilical cord: a viable source for mesenchymal stromal cells. Cytotherapy, 17( 1), 18-24.

[4] Guan, L. , Guan, H. , Li, H. , Ren, C. , Liu, L. , & Chu, J. , et al. (2015). Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in patients with type 2 diabetes. Experimental & Therapeutic Medicine.

[5] El-Kheir, W. A. , Gabr, H. , Awad, M. R. , Ghannam, O. , Barakat, Y. , & Farghali, H. A. M. A. , et al. (2014). Autologous bone marrow-derived cell therapy combined with physical therapy induces functional improvement in chronic spinal cord injury patients. Cell Transplantation, 23(6), 729-45.

[6] J. Vaquero, M. Zurita, M. A. Rico et al.(2018), Intrathecal administration of autologous mesenchymal stromal cells for spinal cord injury: safety and efficacy of the 100/3 guideline,Cytotherapy 20(6),806–819

[7] Bonab, M. M. , Alimoghaddam, K. , Talebian, F. , Ghaffari, S. H. , Ghavamzadeh, A. , & Nikbin, B. . (2006). Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biology, 7(1), 1-7.

[8] (2012). Large-scale production of human mesenchymal stem cells for clinical applications. Biotechnology & Applied Biochemistry, 59(2), 106-120.

[9] B. Cunha, T. Aguiar, S. B. Carvalho et al.(2017), Bioprocess integration for human mesenchymal stem cells: from up to ownstream processing scale-up to cell proteome characterization, Journal of Biotechnology 248, 87–98.

[10] Patrícia Aparecida, Tozetti, Rigotto, S. , Caruso, Amanda, & Mizukami, et al. (2017). Expansion strategies for human mesenchymal stromal cells culture under xeno-free conditions. Biotechnology progress.

[11] F. dos Santos, A. Campbell, A. Fernandes-Platzgummer et al. (2014), A xenogeneic-free bioreactor system for the clinical-scale expansion of human mesenchymal stem/stromal cells, Biotechnology and Bioengineering 111(6) 1116– 1127.

[12]  Campioni,D.,Rizzo,R.,Stignani,M.,Melchiorri,L.,Ferrari,L.,&Moretti,S.,etal.(2010).Adecreased positivity for cd90 on human mesenchymal stromal cells(mscs)isassociated with aloss of immunosuppressiveactivity by mscs.Cytometry Part BClinical Cytometry,76B(3), 225-230.

[13] Moraes, D.A.,Sibov,T.T.,Pavon,L.F.,Alvim,P.Q.,Bonadio,R.S.,&DaSilva,J.R.,etal.(2016).Areductionincd90(thy-1)expression results in increased differentiation of mesenchymal stromal cells.Stem CellResearch&Therapy, 7(1).

[14] Hassan, M. N. F. B. , Yazid, M. D. , Yunus, M. H. M. , Chowdhury, S. R. , & Law, J. X. . (2020). Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International, 2020(1), 1-17.

间充质干细胞来源外泌体（MSC-Exos）是一类由间充质干细胞分泌的纳米级囊泡，直径约为50-150纳米。外泌体起源于多泡体，含有丰富的货物（cargo），如miRNA、mRNA、蛋白质和脂质等，能够介导细胞间的信号传导，调控受体细胞的功能。近年来，MSC-Exos在组织修复、免疫调节和神经保护等领域展现出巨大的应用潜力，成为再生医学和疾病治疗的研究热点。

作用原理及功能

MSC-Exos通过其携带的生物活性分子，影响受体细胞的信号传导和基因表达，从而发挥多种生物学功能。如外泌体中的miRNA和mRNA可以通过细胞间RNA传输的方式，被受体细胞吸收并调控其基因表达。此外，外泌体中的蛋白质和脂质也参与细胞间的相互作用，调节细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等过程。MSC-Exos作为MSCs重要的旁分泌途径，在组织修复与再生、免疫调节、神经保护与再生、心血管疾病治疗以及肿瘤治疗等方面发挥重要作用。

生产

目前，MSC-Exos正走在从实验室到产业化、规模化生产的路上。批量化生产的难点，集中在放大生产存在困难，不同批次产品间的质量差异较大，以及储存和运输面临着不稳定性的风险等方面。不同实验室之间，车间级别、培养规模参差不齐，而赛科成针对不同需求下的外泌体生产需求，定制了如下工艺路线：

➤ 1、片状载体灌流培养

以片状载体作为MSCs的贴壁材料，通过SKC600摆床反应器和专利片状载体细胞培养袋进行灌流培养，收集含外泌体的细胞上清。

✦ 可用于小规模至大规模培养

✦ 一次性封闭系统，降低厂房等级要求，满足药物申报的法规要求

工艺路线：

➤ 2、片状载体填充床灌流培养

在SKC310玻璃罐体反应器中，以片状载体作为MSCs的贴壁材料，搭配篮式搅拌桨进行灌流培养。片状载体由聚酯纤维和聚丙烯支架组成，可为细胞提供良好的贴壁性能；比表面积达1,200-1,500cm²/g，提供极大的贴壁面积和稳定的生长环境。

✦ 可用于小规模至大规模培养

✦ 工艺成熟，已广泛用于疫苗和抗体行业

✦ 操作简便，不需要截留系统也能进行灌流培养

工艺路线：

➤ 3、一次性搅拌式反应器生产工艺

以微载体作为MSCs的贴壁材料，以一次性搅拌式反应器进行逐级放大，可收获上清中的外泌体。

✦ 如使用可降解型微载体，工艺中可以同时回收细胞

✦ 适用于大规模生产

✦ 一次性封闭系统，降低厂房等级要求，满足药物申报的法规要求

工艺路线：

赛科成外泌体反应器系列

作为生物工艺解决方案提供商，赛科成基于多年的技术积淀，构建了覆盖从研发到商业化生产全周期的外泌体生产平台。该平台通过模块化设计的生物反应器矩阵和一次性耗材，可精准适配不同应用场景下的工艺开发需求，为外泌体治疗、药物递送及医学美容领域客户提供端到端的解决方案。

结语

MSC-Exos作为一种新兴的治疗工具，在组织修复、免疫调节、神经保护和肿瘤治疗等领域展现出巨大的应用潜力。尽管其临床应用仍面临诸多挑战，但随着技术的进步和研究的深入，MSC-Exos有望成为治疗多种疾病的有效手段，为患者带来新的治疗选择。未来，通过技术的不断创新和经验的不断积累，MSC-Exos的应用前景将更加广阔。

赛科成SKC900一次性搅拌式生物反应器，兼顾传统搅拌式生物反应器优良的混合搅拌效果与一次性产品的特点，在疫苗、重组蛋白、单抗、干细胞、外泌体等生物制品和新型疗法的上游制备中均有广泛应用。

概  述  

与传统不锈钢反应器相比，一次性生物反应器在批次结束后不需要进行CIP、SIP、取样及补料前后无需对取样阀进行灭菌，也无需等待各管路灭菌降温后再进行操作，节约了操作时间，也节约了工艺介质，过程中的取样及流加操作均通过接管机进行无菌连接，过程操作更简洁方便，相对不锈钢反应器而言，所需备品备件种类少，批次结束后只需更换整个细胞培养袋，没有复杂的管路，更利于问题排查，无清洁验证、SIP验证，节约了工时。

本文使用200L SKC900一次性搅拌式生物反应器进行CHO-S细胞的中试培养，通过设定参数提供稳定可控的培养环境，并在培养过程中对pH、DO进行实时监测，并通过取样对培养上清中的成分、活细胞密度、细胞活率等进行离线分析。

材料与方法：

 设 备：

使用200L SKC900一次性搅拌式生物反应器进行细胞培养。实验中所需要的溶液，在赛科成SKC400配液系统中进行制备。使用无菌接管机、封管机对液体管路进行无菌连接与断开。使用生化分析仪检测培养上清中葡萄糖、营养成分及代谢产物的浓度，使用细胞计数仪对细胞进行计数。

                                                                     图1：SKC900一次性搅拌式生物反应器设备组成

                                                                                              图2：生产配套设备

耗 材：

在SKC900 200L一次性细胞培养袋中进行细胞培养。使用波纹管将2对传统电极进行固定。使用3D一次性储液袋储存大体积液体材料，使用2D一次性储液袋储存50L以下液体材料。使用200L一次性磁力搅拌袋，配合SKC400磁力搅拌配液系统进行溶液配制和转运。使用多联离心管取样套件进行取样。

                                                                          图3：实验中用到的主要一次性耗材

试 剂：

CHO细胞无血清培养基，补料培养基1（使用浓度3%）和2（使用浓度0.3%），D－葡萄糖溶液300g/L。调节pH使用7.5% NaHCO₃。消泡剂的用量在工艺范围之内。实验用水使用WFI。

细 胞 系：

CHO-S细胞从冻存管中复苏，在摇瓶中进行预培养，再转移至50L SKC600摆床反应器中进行扩增。接种至SKC900生物反应器时密度为5×10⁵cells/mL。

                                                                                       图4：种子细胞的制备与放大培养

流 加 培 养：

将一次性细胞培养袋安装到SKC900生物反应器上，培养控制参数参见表1。使用SKC900控制系统对培养体系进行控制。细胞培养袋内加入95L 无血清培养基进行预培养，24h后待溶氧曲线平稳后，校准至100%，打开pH控制，平衡后接种至细胞密度5×105 cells/mL。培养温度维持在36.5℃。pH维持在7.0±0.2。DO值设置在40%，以提高蛋白质的最终积累量。

从第3天开始，每隔一天用3%的补料培养基1+0.3%的补料培养基2进行培养。每天取样，用生化分析仪检测培养基中的葡萄糖浓度，通过补充葡萄糖将葡萄糖浓度维持在6g /L。第14天下罐并收获产物。每天采集样本，测量细胞密度、活力、培养基中的营养成分以及代谢物含量。

                                               表1：SKC900一次性搅拌式生物反应器200L培养参数

实验结果:

SKC900生物反应器中CHO-S的活细胞密度（VCD）和活率如图5所示。随着培养的时间及补料培养基的加入，细胞密度以大概每日2倍的速度进行倍增，约10x10^6 cells/mL时达到峰值，增殖情况良好；但密度到达平台期后细胞活率有所下降，同时伴随着环境压力上升。

图5：CHO-S细胞增长曲线

图6：CHO-S细胞上清生化分析

图7：CHO-S细胞培养过程控制曲线

SKC900一次性搅拌式生物反应器提供了可控的生长条件，因为可以精确地控制培养参数（图7）。在本次流加培养中，细胞生长良好；在Day 14收获当天，产物表达量为5.8g/L，达到预期目标，糖型也符合预期（本部分未予展示）。

结   论:

本次实验使用了SKC900一次性搅拌式生物反应器进行CHO-S细胞的培养与重组蛋白表达生产。对于该细胞系，在DO维持在40%，pH 7.0±0.2， 温度36.5℃，配合3% 补料1+0.3% 补料2的补料策略，能获得良好的培养效果，在Day 14产量达到5.8g/L。SKC900一次性搅拌式生物反应器有多种体积可供选择，可以满足不同规模的工业级哺乳动物、昆虫类细胞培养及其他低剪切力需求的细胞培养需求。