常州三泰科技有限公司

在样品纯化过程中你是否遇到过五花八门的难点，这个问题对于做制备纯化的小孙来说有太多值得吐槽的地方，如样品极性太小正相模式不保留、样品极性太大硅胶固定相洗脱不下来、样品溶解度太差纯化过程析出或拖尾严重及洗脱不下来等情况。在分离纯化的过程中，难免会碰到溶解性比较差的物质，这类物质有时会对分离纯化造成一些负面的影响，如由于拖尾而影响分离度，甚至是直接析出导致管路堵塞，或者少量试剂不能完全溶解至澄清，而样品纯化之前一定要有解决溶解度的办法，否则带着问题上样纯化效果一定不会很理想。解决样品溶解度的问题没有固定答案，具体样品需要具体分析，本文主要和大家分享小孙在纯化过程中如何处理溶解度较差的样品。主要常用以下几种方法：

1. 加助溶试剂

解决溶解度问题最根本的是要找到样品最合适的溶解试剂，但是有时能溶解样品的试剂不适应于样品的分离模式。

如某样品极性很小，乙腈易溶解，但因极性太小在反相柱中不易洗脱，正相模式下正己烷-乙酸乙酯体系不能完全溶解样品导致拖尾致使样品没有分离度。最后解决办法添加第三路管路10%乙腈，虽然乙腈和正己烷不互溶，但是添加的10%乙腈解决了部分样品的溶解度问题，最终纯化结构是能提纯到一半纯品，一半交叉，回收交叉部分按此方法可继续纯化。

1. 用极性相近的试剂置换

反相纯化时除了非水反相，其他体系如甲醇-水/乙腈-水等都会使用到水，但是很多样品用有机试剂溶解后遇水会析出，这种情况下即使可以正常实验也会使峰形拖尾或导致分离度降低，甚至有的样品会直接析出结块导致仪器超压不能运行等情况。

三泰科技的应用实验人员也遇到过上述情况，样品析出情况严重，如何解决这个问题，经过试验发现可以用一种有机试剂代替水相运行即甲酰胺，甲酰胺相对极性7.3，可以与水、甲醇等互溶，可以上样时临时代替水润柱，上样后就不会有析出的情况，甲酰胺在反相体系中没有洗脱能力，极性和水较相近可以代替水运行实验，考虑到成本问题成功运行后可以再用水置换过来。

1. 等度洗脱

当样品在一方流动相中有溶解度时，可以考虑在**分离度的情况下等度洗脱，不需要从低比例慢慢加，减少析出的情况，案例如下：

待分离物质是一种卟啉类化合物的分离过程，该化合物溶解性稍差。通过TLC点板（图1）精确筛选流动相比例的过程中发现，当二氯甲烷的比例低于50%极易拖尾，且各组分之间没有明显的分离度，可能是由于此时二氯甲烷比例偏低，导致溶剂体系的溶解性降低，故拖尾严重；当二氯甲烷高于50%时，各组分之间有一定的分离度，且无明显拖尾现象，但Rf偏大。

图1.从左至右二氯甲烷比例依次增大，左三为50%

综合上述信息，我们决定采用等度淋洗，控制流动相恒定在正己烷：二氯甲烷=1：1。因为此时Rf仍偏大，故在分离过程中，还需要使上样量/硅胶量保持在1/100左右，而且适当降低流速，这些措施都能有效提高各组分之间的分离度。具体分离条件见下表1。

表1. 样品的制备参数设置

按照上述分离条件，最终得到六个不同的组分（图2）第六个峰位于42 CV附近，通过TLC初步鉴定（图3），均为纯的化合物。

图2. 分离的色谱图

图3.分离前后对比点板（前四个产物）

上述3种方法是三泰科技技术人员遇到的样品纯化解决方案个例，相信大家在纯化时也会遇到这种情况，欢迎大家与我们分享解决方案。

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Hi，各位小伙伴们，许久不见，FLASH色谱纯化产品小讲堂终于又可以和大家见面了，前面小编为大家介绍了三泰科技四大名星产品之SepaFlash iLOK上样空柱产品，今天小编带大家了解的是iLOK系列之iLOK-SL上样分离一体柱，小伙伴们记得划重点收藏哦，以免用到时手忙脚乱！

• 介绍

SepaFlash iLOK系列快速分离色谱柱分为iLOK固体上样空柱、iLOK预装柱、iLOK-SL上样分离一体柱三种系列，其中iLOK-SL上样分离一体柱顾名思义兼容上样与分离功能，采用回旋盖设计，预留15%顶部上样空间，为用户提供了便捷的手工组装功能，以及灵活多样的上样方式：方便液体进样或固体上样。独特的专利装载技术为纯化化合物提供了高效的解决方案和良好的再现性。

当遇到样品不易溶解时需要采用固体上样方式，从而有效改善分离纯化的效果。在固体上样的方案中，通常的做法是在分离柱前通过转接头再接入一支上样空柱，空柱中放入完成拌样处理的样品，这种方法的缺点是空柱以及转接头自身的死体积易导致样品的扩散，从而降低分离效率。为此三泰科技推出iLOK-SL上样分离一体柱，在分离柱前端预留15%的空间用于固体上样，从而将样品与分离填料之间的死体积降至最低，确保获得**的分离效果。

二、特点

• 操作步骤

！！！装填过程中注意佩戴防护眼镜、防尘口罩，并在通风橱内进行操作，预防固体样品等颗粒吸入人体。

• 产品信息

iLOK-SL上样分离一体柱具有多种流行尺寸可供选择（3.5g， 10g， 20g， 35g， 70g， 100g， 185g， 280g），纯化范围可以从毫克到百克，预装填的固定相包括硅胶、氧化铝、C18、C8、C4、Diol、CN、NH2、SAX或者SCX，能满足用户的多种需求。

无定形硅胶，粒径40−63 µm，孔径60 Å

（比表面积500 m2/g，pH 6.5–7.5，上样量0.1-10%）

※ 兼容市场上所有快速液相制备色谱系统。

在分离纯化的过程中，相信大家都会遇到极性很接近的样品，对于此类样品一般解决办法有很多如减少上样量、降低流速以及改变流动相的配比等，这些措施都能有效提升样品的分离度。若上述方法也不能改善分离度还可通过增加柱长来解决，增加柱长可直接更换大规格的色谱柱或者同内径色谱柱串联使用，当实验过程中没有大规格色谱柱时可选用同内径色谱柱串联的方法，现提供一个相关案例说明色谱柱串联的使用效果。

实验部分

1、样品信息

待分离样品是一种荧光染料类化合物，主要包含两个成分A和B，且两者极性极为接近（见图1）。产品结构式中含羧基，故需要添加适量的乙酸以降低产品拖尾的影响。

图1.待分离反应液点板图

2、样品制备

下表1为两次样品制备实验参数的对比。

表1.两次分离过程的条件对比

在药物研发过程中，对药物中的杂质含量控制是药物质量控制的关键，而对杂质控制的核心是对药物中每一个杂质的活性逐一制定质量控制限度，这就要求对该药物中所有杂质进行分离纯化、结构确证并进行相关测试。

杂质分类有很多种，一般分为有机杂质、无机杂质、溶剂残留等，其中有机杂质主要来源于合成工艺的过程，包括起始原料、催化剂、试剂等，对这部分杂质的纯化可追溯其合成路线才能充分了解引入的杂质情况针对性的提纯；无机杂质一般包括无机盐或金属杂质等，一般按照药典对其杂质进行定量；残留溶剂一般也是合成工艺引入可通过气相色谱检测，经旋蒸、冻干等方式除去。对杂质的定性定量在对指引药品制备工艺的研发和优化具有指导意义，只有在充分了解杂质并对其有效控制，药品质量控制才能有的放矢。

实验部分

1.样品分析

样品主要提纯粗品中含量少的杂质组分，液相检测杂质纯度含量约35%，且极性较小，液相需要90%的甲醇等度才能洗脱下来。

图1  粗品的HPLC分析谱图

2.样品的分离纯化方法

取1g粗品溶于4ml甲醇中，超声直至澄清状态，用注射器将溶解后的样品推进反相柱中。

3.案例小结

根据制备谱图2可以看出，主峰和杂质目标峰不仅基线分离且分离度较高，为了提高效率后续制备可加大上样量至2g。制备后通过HPLC检测，目标组分纯度大于98%（HPLC分析图谱参见图3）。

图2  Flash粗品纯化谱图

图3  制备后HPLC分析谱图

结果与讨论

上述实验的杂质纯化较简单，因为粗品中杂质纯度含量较高且与主峰能达到基线分离方便后续制备提高进样量。但是大部分杂质提纯过程都困难重重，如杂质组分含量太低，分离度太低无法一次提纯到要求的纯度含量等，这种情况下第一步需要先将杂质富集起来，不追求一针提纯的杂质含量纯度，加大上样量力求快速富集，第二步对富集后的杂质精细纯化，将富集后的杂质后处理再优化方法精制提纯。

图4和图5是杂质的制备谱图，样品是某CRO公司提供，需要提纯目标杂质定性但杂质含量较低且分离度不高。三泰科技的应用工程师对杂质进行先富集再精制的路线，成功将杂质含量只有2%的组分提纯到95%以上。

图4  粗品富集杂质制备谱图

图5  富集后杂质精细纯化谱图

关于SepaFlash® C18AQ反相分离柱系列产品

三泰科技推出的SepaFlash® C18AQ反相分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。

表2. SepaFlash® C18AQ反相分离柱参数

（填料:High-efficiency spherical C18(AQ), 20 – 45 μm, 100 Å）