深圳市恒谱生科学仪器有限公司

        本文的重点是快速液相色谱和高效液相色谱。没有一种**的协议适合每一种分离目的。因此，建议为您的特定应用程序优化方法。通过本文中列出的建议以及一些前期阅读和测试，您将轻松纯化您正在寻找的组件。

        一、快速液相色谱纯化

        使用快速色谱法进行纯化的缺点是该方法固有的分辨率较低。快速液相色谱柱使用更大的粒径和柱容量，允许使用更多的起始材料，但以分辨率和纯度为代价。如果化合物不需要更高的纯度，或者如果下一步将进行 HPLC，这可能是您的选择。

        1、确定溶剂系统

        样品的纯度（即混合物中有多少化合物）可以使用薄层色谱法 (TLC) 和组分的相对极性进行定性测定。使用 TLC 预先筛选**流动相和固定相将节省时间和金钱。根据所使用的溶剂，您可能需要在通风柜中运行色谱柱，因为存在潜在的危险烟雾。

        2、确定要使用的列

        选择分离柱时要考虑样品量。色谱柱装载量因粒径和体积而异。一般来说，快速液相色谱柱的最大装载量约为硅胶重量的 10%。较大的色谱柱能够处理千克数量的色谱柱，但如果您没有那么多起始材料，那么您只会在硅胶和额外的溶剂上浪费金钱来运行这些大型色谱柱。在确定液相分析柱、基质和溶剂后，您就可以进行快速分离了。

        3、液相色谱柱

        无论您是自己装柱还是购买一根预装柱，按重量计算硅胶与化合物的比例（即硅胶：化合物）都将帮助您实现更有效的分离。恒谱生提供各种硅胶色谱柱，像uHPLCs高效液相C18-AQ分析柱对亲水性和极性化合物具有更强的保留能力和选择性。

        如果包含了分离不太复杂的溶液需要 30:1 到 50:1 的比率，但更复杂的分离可能需要高达 120:1 的比率。手动运行色谱柱时，切勿让溶剂管线低于硅胶，否则气孔会在硅胶上形成看起来像裂缝的长线。这大大降低了分离的效率。

         二、HPLC纯化

       在 HPLC 上运行样品相当简单，因为在快速液相色谱柱上预纯化过程中确定的许多参数都可以应用于此过程。如果您在没有预纯化步骤的情况下运行 HPLC 分离，请考虑使用上面列出的指南来开发合适的 HPLC 方法。使用 HPLC 时的另一个考虑因素是计算的背压。由于 HPLC 色谱柱的粒径更小，可实现更高质量的分离，因此这些系统往往在高压条件下运行，而闪蒸分离的压力相对较低。使用有关粒径和形状、色谱柱内径和溶剂规格的信息计算估计的背压。

        最后，与恒谱生技术支持专家进行简短讨论可以节省您宝贵的时间，并使您能够在瞬间分离化合物！

         液相色谱是世界各地实验室使用的流行纯化技术。如果系统设置和操作正确，它可以立即从混合物中分离出所需的化合物。学习如何使用和制备缓冲液和溶剂是能提高系统性能的重要技巧之一。准确制备和正确选择缓冲液对于在液相色谱中获得可重复的结果至关重要。

          一、了解您的化合物

          如果您正在寻找混合物中的特定化合物，您应该使用最能将您的分析物与其他分析物分开的缓冲液/溶剂组合。例如，了解极性和溶解度（极性或非极性）、电离、您正在寻找的紫外吸光度将有助于指导您使用特定的色谱柱和溶剂组。

          二、纯度

         使用较低等级且成本较低的试剂来制作缓冲液以节省一些钱是很诱人的，但从长远来看，它最终会变得更加昂贵。与含有最少或不含杂质的 HPLC 级试剂相比，纯度较低的试剂会导致不需要的峰和嘈杂的基线。它们还会对您的系统造成严重破坏，造成阻塞，从而导致系统故障和更昂贵的维护费用。所有试剂和溶剂，包括您使用的水，都应该是最高质量的 HPLC 级，以减少缓冲液中不需要的微粒。高级试剂的成本可能比低级试剂略高，但纯度的差异是值得的。HPLC 级试剂还有助于获得更一致的结果并保持系统平稳运行。

        即使是使用高纯度实验级别的溶剂，也需要在进入色谱系统前进行过滤，采用恒谱生溶剂过滤器可以有效过滤化学污染等杂质进入系统，通用于流动相或输液泵，配套用于外径1/8英寸或1/16英寸的管子，放置于流动相溶剂瓶中，过滤杂质。过滤后，溶剂应储存在有盖的容器中，以防止被灰尘或其他不需要的材料污染。

           四、避免气泡

        在与您的系统一起使用之前对缓冲液进行脱气或真空过滤可以最大限度地减少流动相中的空气和微粒。如果液相色谱系统中发生流动相脱气，主要会影响泵和检测器。为了解决这个问题，在将新制备的流动相泵入 HPLC 系统之前进行脱气，连同在线脱气器，应彻底脱气以去除所有溶解的气体。最有效的脱气形式是用氦气或其他低溶解度气体鼓泡。如果该方法可用，建议在整个分析过程中以非常低的水平持续对流动相进行脱气。

        五、定期检查

         细菌几乎可以在任何溶液中适应和生长，甚至是有机溶剂，具体取决于浓度。为防止细菌生长堵塞色谱柱筛板，每次制备新的缓冲液批次时更换缓冲液容器，检查缓冲液瓶/袋是否有细菌生长迹象。摇晃或搅拌时出现浑浊的溶液应丢弃。使用抑菌剂（例如 0.02% 叠氮化钠）处理会延长溶液的储存时间，尽管这些试剂可能会影响您的色谱图。

        六、新鲜配置

        恒谱生建议稀释缓冲液的有效期为一周。这种做法可确保缓冲液的 pH 值不受长期储存的影响，并且不会出现微生物生长。pH 值变化和微生物生长都会影响您的色谱运行并导致运行之间的不一致。虽然您可以添加稳定剂，例如焦亚硫酸钠，但这些试剂会影响光学和色谱结果。

        最后，液相色谱法可能是一项具有挑战性的技术。遵循上述关于如何准备和使用缓冲液进行纯化的提示，将有助于使每次运行的一致性和可重复性。

        质谱 (MS) 使研究人员能够研究许多特性，例如样品的分子量、结构、特性、数量和纯度。当与液相色谱技术相结合能成为一种强大的分析工具，能够从复杂的生物混合物（如牛奶、血清和全脂）中提取有关一系列化合物的有意义的数据，包括药物代谢物、肽和蛋白质-细胞裂解物。

        一、液相色谱与质谱

        在将样品引入 MS 仪器之前，通常通过过滤掉颗粒物、浓缩分析物、脱盐和通常分离出可能导致背景离子或抑制电离的化合物来制备样品。大多数情况下，许多或所有这些步骤都是由 HPLC、UPLC 系统完成的。样品制备需要对样品进行预处理。比如流动相进系统前，通过恒谱生溶剂过滤器过滤颗粒污染物。

        HPLC、UPLC 这些系统可以在高压/低流速下运行，并且允许用户通过直接连接、在线、与MS 通过电离装置。如果是超高压液相色谱系统，系统内部压力非常高，对于色谱耗材也需要uhplc专用。2.1#超高压UPLC保护柱预柱捕获样品中增加背压和影响基线噪音的污染物，延长色谱柱的使用寿命。

        电离装置的早期化身要求样品在真空下电离，严重限制了可以分析的化合物的选择。较新的技术，如电喷雾电离 (ESI)，现在可以在大气压下进行电离，从而大大扩展了曲目。一旦离子化，分析物（主要由水或质子或电子的添加或损失产生的离子）将与中性（不带电的）分子进行机械和静电分离。根据仪器的配置，允许所有或选定的子集通过检测器，该检测器绘制离子相对于信号强度（表示丰度）的 m/z 图表。

        二、串联质谱

        从单级 MS 获得的 m/z 信息非常有价值，有时可用于识别小分子。但对于更大、更复杂的分子，通常需要互补的结构信息。通过 LC/MS 分析复杂的蛋白质混合物通常从胰蛋白酶消化过夜以产生肽开始，然后通过收集串联 MS 数据在肽水平鉴定蛋白质。

         在串联 MS 中，样品依次通过仪器的不同阶段，每个阶段都会对其进行选择或破碎等过程。例如，在三重四极杆 MS 中，第一阶段选择特定的 m/z 范围，丢弃其余部分。然后，这些剩余的离子通过在第二阶段与中性分子碰撞而碎裂。新破碎的离子然后进入第三阶段，根据实验，扫描产物离子的光谱或选择性地监测一些离子。然后将这些光谱与实际或理论光谱数据库进行比较，以确定它们的身份，使研究人员能够将它们来自的母分子拼凑在一起。

        三、LC/MS 的其他用途

        LC/MS 的强大功能也经常用于识别蛋白质修饰，例如磷酸化和二硫键桥接。在 LC 提供的分离和串联 MS 丢弃非分析物离子的能力之间，LC/MS 是许多不同应用的选择。

        UHPLC是一种专门的色谱方法，与 HPLC 相比，它运行速度更快、分辨率更好并且使用的溶剂更少。UHPLC 通过使用填充较小颗粒（通常直径小于 2 µm）的较小色谱柱来实现这一点。生物化学、细胞和分子生物学、临床医学和许多其他领域的研究人员依靠 UHPLC 从混合物中分离不同类型的分子——无论这些分子是蛋白质、肽、代谢物、药物化合物还是其他化学物质。

        尽管 UHPLC 的性能明显更好，但它并不总是**选择。在您考虑改用 UHPLC 时，恒谱生将帮助您区分重要和不重要的内容。

         一、为什么选择 UHPLC？

        尽管 UHPLC 和 HPLC 在各种情况下都有优势，但如果您在五分钟内分离两种组分并且每天只进行几次分析，则不太可能需要 UHPLC，因为 HPLC 的分离度既足够又相对快速。

        即使您不需要更高的分离能力，UHPLC 仍然可以提高您的通量。与 HPLC 色谱柱相比，uhplc更高的色谱分离度可用于提高复杂样品的分离能力，或通过使用更短的色谱柱并保持分离度来提高分析速度。

        二、然而，UHPLC 并非没有缺点。由于 UHPLC 在色谱柱中使用较小的颗粒，因此不适用于脏污或未过滤的样品。使用未过滤的样品可能会导致色谱柱堵塞。可以使用恒谱生在线过滤器或者保护柱安装在柱前进行过滤，避免色谱柱堵塞。通常，UHPLC 需要更高的样品和流动相清洁度，这会增加溶剂和样品制备的额外开销。

        三、选择 UHPLC 的注意事项

         因为 UHPLC 在色谱柱内使用较小的颗粒，例如，需要更大的力来驱动溶剂和样品通过色谱柱。因此，UHPLC 需要能够在比 HPLC 中使用的泵更高的压力下工作的泵。

         另一方面，虽然 UHPLC 系统的初始成本通常高于其对应的 HPLC 系统，但总体拥有成本实际上可能更低。与 HPLC 系统相比，UHPLC 系统可以用更少的试剂产生更快的结果，并且增加的通量可以提高生产力。在这种情况下，UHPLC 系统较高的初始成本实际上可能会在几年内节省实验室资金。

         四、未来发展

         尽管存在差异，但新型柱填料开始模糊 HPLC 和 UHPLC 之间的界限。例如，对于 HPLC 和 UHPLC，新的“核壳”或“多孔”颗粒提供比传统柱颗粒更好的性能。核壳颗粒具有更大的表面积，这意味着它们在较低的工作压力下优于传统的颗粒表亲。这意味着使用核壳颗粒（例如来自恒谱生的核壳颗粒填料，批次稳定性一致，可重复利用），现在可以使用 HPLC 的较低压力实现 UHPLC 的“超”效率。

          对于 HPLC 和 UHPLC，平衡设备成本和性能变得更加灵活。无论您需要简单的高通量分离还是更高的分离能力，UHPLC 都在不断发展以满足比以往更多类型的需求。

        一、分离模式

        选择色谱柱的首要任务是选择分离模式。分离分子的方法有很多，其中应用最广泛的包括反相、正相、亲水相互作用、离子交换和尺寸排阻 HPLC。还有一些不太常见但更专业的分离模式，例如使用手性固定相或流动相的特定手性色谱。

        反相色谱柱通常用于非极性或弱极性有机化合物，它包含非极性固定相（如 C18），通常与极性流动相配对。恒谱生C18 AQ 反相色谱柱在100%水下拥有超越同类产品的寿命，适于极性较大的物质在高水相条件下的分析。但是该方法不适合应用于蛋白质，流动相通常含有低 pH 值的乙腈或甲醇，可能会使蛋白质变性，因此会产生伪峰或导致蛋白质聚集和色谱柱堵塞。

        二、柱长

        确定分离模式和色谱类型后，请考虑色谱柱长度。理想的柱长在某种程度上取决于您的特定样品和分离模式。一般来说，更长的色谱分析柱需要更长的运行时间，但会产生更好的分离效果。柱长（有时称为“床高”）对于根据大小分离蛋白质特别重要。

        三、填料的大小和类型

        HPLC 柱床由直径通常为 2 至 10 μm 的球形功能颗粒构成。小于 2 μm 的粒径用于UHPLC，超高压液相色谱是在非常高的压力下运行，因此它使用比 HPLC 更小的颗粒。恒谱生2μm硅胶基质色谱填料，孔分布均匀、抗压强度高，由于表面羟基活性高所以在中高压情况下能达到快速分离纯化的效果。一般而言，较小的粒径可提供更高的分离率——但需要注意的是背压也更大，以便将流动相泵入密度更大的色谱柱。

        三、色谱填料的材料

        常见的选择有二氧化硅、羟基磷灰石和交联聚合物树脂。常见的疏水烷基链有 C4、C8 和 C18 等长度。通常，该材料对目标分析物具有一定程度的选择性——做出这种选择对于优化分离度很重要。例如，C18 更常用于分离肽或小分子，而 C4 更适用于蛋白质。

        技术发展也产生了新的粒子类别。一种称为表面多孔颗粒 (SPP) 或核壳颗粒的新型二氧化硅基材料有望实现通过2 μm的粒径实现更高的分离效率。通常，常规粒径小于 2 μm 的 HPLC 色谱柱需要专门的 UHPLC 泵或系统来处理较高的背压。与球形和全多孔的传统二氧化硅颗粒不同，SPP 颗粒由一个实心二氧化硅核组成，其上覆有多孔二氧化硅壳，这些颗粒的优点是它们表现出像 2 微米颗粒一样的效率，颗粒尺寸从 2.6 微米及以上，但在略高于一半的背压下运行。