近年来,随着全球对生物制药和精准医疗需求的持续增长,对高效、特异性蛋白酶的需求也在不断攀升。国内企业在研发和生产方面的实力逐渐增强,尤其在Kex2蛋白酶的生产技术、纯度提升和应用开发等方面取得了显著进展。Kex2蛋白酶(E.C.3.4.21.61)凭借其卓越的特异性和高效性,在生物制药、蛋白质研究和工业生产等领域的重要性日益凸显,成为众多生物技术企业关注的焦点。
* 重组双碱性氨基酸内肽酶(重组Kex2蛋白酶)的结构分析
来源解析
Kex2蛋白酶(E.C.3.4.21.61)属于枯草杆菌蛋白酶家族,为酵母自身编码的一种前体加工酶,分为Kex2蛋白酶和重组Kex2蛋白酶两大类。天然存在的Kex2蛋白酶,主要是通过传统的发酵技术从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中提取和纯化,生产过程较为复杂,产量相对较低,可能会含有少量的宿主蛋白和其他杂质。
冀百康生物重组Kex2蛋白酶采用重组毕赤酵母(Pichia pastoris)高效分泌表达技术,经分离纯化得到,适合进行大规模生产,活性更高,纯度更高,宿主蛋白残留少,质量更加稳定。
作用机制探秘
识别与结合
· 特异性识别位点:能够专一性地识别和切割 Lys-Arg,Arg-Arg,Pro-Arg 等双碱性氨基酸的羧基端肽键。这种特异性识别是通过其独特的活性中心实现的,该活性中心能够精确地识别并结合到目标肽段的特定序列上。
· 底物结合:酶的活性位点与底物的双碱性氨基酸残基对结合,形成酶-底物复合物.这种结合是通过氢键、疏水作用和离子键等多种相互作用力共同作用的结果。
Ca2+依赖性
· 重组Kex2蛋白酶的活性依赖于Ca2+的存在。Ca2+在酶的活性中心中起到稳定酶结构和促进催化反应的作用。这种依赖性使得重组Kex2蛋白酶酶在没有Ca2+的环境中活性大大降低,从而在实验和应用中需要添加Ca2+以维持其活性。
催化过程
· 催化三联体:重组Kex2蛋白酶的催化机制依赖于其丝氨酸蛋白酶的催化三联体,即丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)和天冬氨酸(Asp)这三个氨基酸残基协同作用,形成一个有效的催化中心。
· 质子转移:组氨酸在反应中起到质子转移的作用,帮助稳定过渡态并促进反应的进行。
· 水解反应:随后,水分子进入活性中心,与酰基-酶中间体发生水解反应,最终释放出切割后的肽段。
切割特性
· 切割位点:重组Kex2蛋白酶特异性切割双碱性氨基酸残基对的羧基端肽键。例如,在Arg-Arg序列中,切割发生在第二个Arg的羧基端,从而将蛋白质前体切割成成熟的蛋白质.
· 非特异性切割的避免:与胰蛋白酶不同,Kex2蛋白酶不能识别和切割单一碱性氨基酸(如Arg或Lys)的羧基端肽键。这种特异性避免了不必要的非特异性切割,提高了切割的准确性.
* Kex2切割点位
(来源:Improving the Secretory Expression of an -Galactosidase from Aspergillus niger in Pichia pastoris - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/a-The-Kex2-signal-peptide-cleavage-site-The-extracellular-b-and-intracellular-c_fig5_306394202 [accessed 6 Jan 2025])
优势亮点清晰
▷ 高特异性
能够专一性地识别和切割 Lys-Arg,Arg-Arg,Pro-Arg 等双碱性氨基酸的羧基端肽键,避免非特异性切割。
▷ 高纯度和活性
重组Kex2蛋白酶通过基因工程技术生产,具有更高的纯度和活性,避免了天然Kex2蛋白酶来源有限和纯度不高的缺点。
▷ 稳定性强
在偏酸性环境中(pH 5.0-6.0)稳定,且不受常规丝氨酸蛋白酶抑制剂(如PMSF、TPCK)的抑制。
▷ 无动物源性
重组Kex2蛋白酶采用重组毕赤酵母高效分泌表达技术的生产,过程中不使用动物来源的原料,避免了动物病毒和外源因子的污染。
产品参数
* 实际参数以产品每批次COA为准;
应用领域广泛
生物制药
胰岛素类似物生产:重组Kex2蛋白酶在重组胰岛素及其类似物(如门冬胰岛素、地特胰岛素、谷胰岛素)的生产中用于前体蛋白的酶切加工。
多肽药物生产:在GLP-1类似物及其他多肽药物的生产过程中,重组Kex2蛋白酶用于工艺酶切或转肽。
外源蛋白表达:在毕赤酵母表达系统中,设计蛋白序列时引入重组Kex2蛋白酶切位点,使在后期的分泌表达过程中被酵母自身重组Kex2蛋白酶识别而酶切,从而实现重组蛋白的大量表达。
蛋白质研究
酶解和肽图分析:重组Kex2蛋白酶用于蛋白质的酶解和肽图分析,帮助研究蛋白质的结构和功能。
蛋白质测序:在蛋白质测序过程中,重组Kex2蛋白酶可用于切割蛋白质,生成适合测序的肽段。
生物技术
酵母表达系统:在毕赤酵母表达系统中,重组Kex2蛋白酶用于外源蛋白的前体加工,确保目标蛋白的正确折叠和分泌。
基因工程:在基因工程研究中,重组Kex2蛋白酶可用于切割特定的蛋白质片段,以便进行进一步的基因克隆和表达。
其他应用
食品工业:在食品加工过程中,重组Kex2蛋白酶可以用于蛋白质的改性,改善食品的口感和营养价值。
化妆品行业:用于化妆品中蛋白质的加工和改性,以提高产品的功效。
结语
重组Kex2蛋白酶作为一种高纯度、高活性、特异性强的酶,凭借其在生物制药、蛋白质研究和工业生产等领域的广泛应用,已经成为现代生物技术不可或缺的重要工具。随着生物技术的不断进步和市场需求的持续增长,重组Kex2蛋白酶的应用前景将更加广阔。未来,冀百康生物将继续加强重组Kex2蛋白酶在研发和生产方面的技术创新和质量控制,以提升产品竞争力,满足不断增长的市场需求。
* 本品仅用于科研生产应用,不得用于人体。
END
参考文献:
1、王彤, 徐岩, 喻晓蔚. 毕赤酵母Kex2蛋白酶的同源表达及酶学性质 *[J]. 中国生物工程杂志, 2019, 39(1): 38-45 https://doi.org/10.13523/j.cb.20190105
2、Improving the Secretory Expression of an -Galactosidase from Aspergillus niger in Pichia pastoris - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/a-The-Kex2-signal-peptide-cleavage-site-The-extracellular-b-and-intracellular-c_fig5_306394202 [accessed 6 Jan 2025]
近年来,中国肠激酶(Enterokinase, EK)市场持续展现出稳健增长的趋势。得益于生物技术的飞速进步,肠激酶在生物加工和制药行业中的应用日益增多,从而推动了市场需求的持续攀升。与此同时,国内企业在肠激酶的生产技术及产品质量上均取得了显著进步,逐步缩小了与国际领先水平的差距,展现出强劲的竞争力。
* 图片来源于网络
肠激酶分为天然肠激酶和重组肠激酶(rEK)两大类。天然肠激酶主要来源于动物的肠道组织,受到其他蛋白酶的污染,纯度低且提取分离成本较高。而重组肠激酶通常是通过基因工程技术得来的。冀百康重组肠激酶采用重组毕赤酵母高效分泌表达技术,经多级层析纯化的工序的来的重组肠激酶液体/冻干粉。相比从动物肠道组织中提取的天然肠激酶,重组肠激酶具有更高的纯度和活性,生产过程更加安全、可控。
重组肠激酶属于丝氨酸蛋白水解酶家族,其作用机制主要是特异性识别并切割特定的肽键序列。重组肠激酶能够特异性地识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)序列,并水解Lys C端的肽键,从而将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶,启动各种酶原活化的级联反应。这种高度的专一性使得重组肠激酶在切割融合蛋白时能够精确去除不需要的标签部分,保留目标蛋白的完整性和功能。
*肠激酶的切割过程
▷ 高度专一性
重组肠激酶能够特异性识别并切割特定的肽键序列,保证了切割的精确性和产物的纯度。
▷ 高纯度和活性
重组肠激酶通过基因工程技术生产,具有更高的纯度和活性,避免了天然肠激酶来源有限和易污染的缺点。
▷ 广泛适用性
重组肠激酶在广泛的pH范围围(4.5~9.5)和温度条件下都能保持活性,适用于多种实验条件和应用场景。
▷ 无动物源性
与动物源肠激酶相比,重组肠激酶无动物病毒、无致病物质、无外源因子污染,生产过程更加安全、可控。
产品参数:
* 实际参数以产品每批次COA为准;
应用领域广泛
生物制药
重组肠激酶在生物制药领域主要用于切割和纯化重组融合蛋白。通过特异性切割融合蛋白的特定位点,可以去除融合蛋白中的非目标部分,获得高纯度的目标蛋白。这对于生产高质量的重组蛋白药物至关重要。
基因工程
在基因工程中,重组肠激酶用于切割和修饰各种基因工程产品,如重组抗体、细胞因子等。其高度的专一性保证了切割的精确性和产物的纯度。
食品工业
肠激酶在食品工业中也有应用,主要用于食品的加工和改良。例如,通过肠激酶的催化作用,可以改善食品的口感、营养价值等。
医疗诊断
重组肠激酶在医疗诊断领域也有潜在的应用,如用于酶联免疫吸附试验(ELISA)等诊断技术的开发。
重组肠激酶作为一种重要的生物酶,在生物技术和制药行业中具有广泛的应用前景。其高纯度、高活性、高度专一性和无动物源性污染等优势,使其成为生物加工、制药、食品和医疗诊断等领域不可或缺的工具。随着生物技术的不断进步和市场的不断拓展,重组肠激酶的应用领域将进一步扩大,为相关行业的发展提供有力支持。
* 本品仅用于科研生产应用,不得用于人体。
“重组胶原蛋白是智商税吗?”
“医学生揭秘胶原蛋白真相!”
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……
一打开小某书,搜索“胶原蛋白”关键词,相关笔记多达132万余条,远远超过玻尿酸(透明质酸钠),再搜索“重组胶原蛋白”,相关笔记已达2万+,胶原蛋白相关的热度可见一斑。
*小某书搜索关键词的笔记数
近年来,胶原蛋白中的细分类别之一 —— 重组胶原蛋白,得益于抗衰修护市场的持续扩大,加之科学护肤群体的年轻化态势,作为“全球抗衰修护第四级成分”,被推向了风口浪尖,加上资本市场的频繁动作和一众企业冲刺IPO的竞速,让一直以来颇为“低调”的赛道,被寄予了“超越”玻尿酸千亿市场份额的厚望。
在内在老化中,胶原蛋白的产生从 30 岁开始减慢。因此,构成整个皮肤的真皮密度降低,导致表皮等浅表结构减弱,同时,作息饮食的不规律导致炎症因子不断堆积。随着年龄的增长,皮肤也会失去弹性,细胞代谢减缓,厚度增加,最终出现炎症、衰老。 除了合成量下降之外,胶原纤维还经历了许多变化,从根本上改变了它们的物理特性。这些变化随着年龄的增长而增加,并且可能因紫外线、污染、吸烟和饮食不均衡引起的外在衰老而加剧。这导致负责胶原蛋白分解的酶(称为基质金属蛋白酶 (MMP))的产量和活性增加。同时,金属蛋白酶抑制剂,即所谓的TIMP(金属蛋白酶组织抑制剂)的合成和活性降低。 此外,胶原蛋白由于其寿命长,是糖化等缓慢酶促反应的首选目标。这种糖化作用类似于焦糖化,使胶原纤维变硬,导致弹性丧失和下垂,这是老化皮肤的典型特征。最后,随着年龄的增长,活性氧会积累,从而引发氧化反应导致巨噬细胞分泌白介素6而造成肌肤敏感。
重组人小分子胶原蛋白的亮眼优势
作为抗衰领域一张亮丽的“新名片”,重组小分子胶原蛋白有别于其他功效成分,这也使得其成为名副其实的“全球抗衰修护第四级成分”。相较于功效三巨头——玻色因针对皮肤中糖胺聚糖,靶点较为单一;烟酰胺原料中成分烟酸,刺激性,对皮肤有耐受,并不适合所有肌肤;胜肽虽分子量小,但目前只能通过化学制备的方法生产,易出现化学残留,且多肽精准度不高。而重组人小分子胶原蛋白,技术上做到与人体自身的序列一致,其生物学相容性更佳,兼顾高活性优势的同时,高透皮吸收使其具有突出的功效性、低免疫等优势。
# 合规性
重组人小分子胶原蛋白完全符合以下标准:
为了进一步夯实重组人小分子胶原蛋白在抗衰修护功效方面的突出优势,冀百康生物依托自身特有的基因工程重组技术搭配合成生物学技术,结合科学文献中关于化合物和药物透皮的500道尔顿规则指出:“正常情况下,透皮分子量的分界线是500道尔顿。且在不同的皮肤状态与干预方法下,透皮分子量的差异在500-5000Da之间”,精准酶切分子量片段,获得兼顾高活性表达和高吸收的“双高”优势重组人小分子胶原蛋白。
*来源:Bos JD, Meinardi MMHM. The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds and drugs.Exp Dermatol 2000: 9: 165–169. C Munksgaard, 2000
核心技术、专利原料和配方工艺是形成冀百康生物核心的科技力量,其中包括20多款核心原料的储备、14项的专有技术、200多个配方。
完善的配方体系
自2022年3月冀百康生物首.创重组人小分子胶原蛋白上市以来,坚持以客户需求为导向的市场开发战略,加快建立与下游客户紧密的、完善的产品标准体系,结合自身20多年的合成技术,丰富重组人小分子胶原蛋白在下游配方的应用;研制出与多肽、植物提取物、中药成分及高活性酵母多种类配方体系,该系列配方具备报送资料完整,搭配专利成分,且第三方实测有效的从原料到配方再到成品的解决方案,下游客户可进行直接使用,节约成本的同时提升品牌竞争力。
随着冀百康生物对重组胶原蛋白领域的研发投入,不断突破的科研技术和完善的配套服务,以及逐渐成熟的下游市场,在未来,冀百康生物将为不同领域客户持续输出重组胶原蛋白系列原料及精准服务,相信该赛道必会迎来更大的爆发。
*参考文献:
1、Sylvie Ricard-Blum. The Collagen Family. Cold Spring Harb Perspect Biol (2011);3:a004978.
2、唐颖 赵华。中国医药报《含烟酰胺化妆品并非人人适用皮肤敏感人群、皮炎患者慎用高浓度含烟酰胺产品》
细胞是生物学实验的重要材料,也是生物细胞学实验的基础。药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。在细胞培养和消化的操作过程中,受人员操作和环境条件的影响比较大,因此每个环节都有可能导致操作的失败。以下是我们汇总了关于细胞培养和细胞消化的小贴士,希望能给正操作细胞培养和细胞消化的研发人员带来帮助。
细胞系身份需明确
之所以选定某种细胞系开展实验,是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性,疾病特性,功能特性,基因表达特性等。一旦用错了细胞株,对研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。
而近年来,多个权威机构发现细胞系在培养和流通过程中,出现了很严重的交叉污染。据不完全统计,单就HeLa细胞系导致的污染致使3万多篇论文结果的准确性存在问题(doi:10.1371/journal.pone.0186281)。而这种情况不仅仅限于HeLa细胞。多个权威机构研究人员检测发现超过451个细胞系已被其它细胞完全吸收,在所检测细胞中污染占比46%,可见细胞交叉污染的现象非常普遍。因此,做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株,最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。
细胞培养大致分为两种,一种是悬浮细胞培养,一种是贴壁细胞培养,无论是哪种方式,进行细胞培养时一般会通过以下几个步骤:
当然以上只是细胞培养过程的一个基本框架,实际操作可能会因细胞类型、实验要求和实验室的标准操作规程而有所不同。
细胞消化是研发人员在操作细胞培养过程中一个步骤,一般细胞长至80%-90%密度则需要传代消化,贴壁细胞传代前,需要把细胞用消化试剂从培养容器表面解离出来,细胞得以分离成单个悬液传代至含新鲜培养基的新容器内;常见的细胞消化方法有三种:酶消化法、离子螯合法、机械消化法。其中,酶消化法是用得最多的,主要使用胰蛋白酶,一般浓度在0.25-0.5%,消化的时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化。一般来说,0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞,在37℃条件下消化1-5分钟就足够了。需要注意的是,Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性,因此不含Ca2+、Mg2+,含EDTA的胰酶活性更高; 最后,可用含血清的培养基终止胰酶消化。
胰蛋白酶大致可以分为两种,一种是传统使用的动物源性的胰蛋白酶,主要提取自牛或猪的胰.腺组织,其缺点是会带来病毒污染的风险;另一种则是非动物源性胰酶,即利用基因重组技术生产的重组胰蛋白酶。重组胰蛋白酶具有许多潜在用途,包括用于生产药品、用作研究工具以及生物技术应用,例如蛋白类药物的生产、细胞的分离、疫苗生产以及用于细胞分析的组织样本的制备,同时解决了传统使用的猪或牛胰蛋白酶可能带来病毒污染的风险。我国2020版药典第一次收录了无动物源性重组胰蛋白酶的质量标准。总体而言,重组胰蛋白酶在生物药及科研领域是不可缺少的工具酶。
重组胰蛋白酶在实际应用中的使用步骤:
① 配制缓冲液:用灭菌水配制10L HBSS平衡盐溶液。
HBSS平衡盐溶液配方:400mg/L KCl,60mg/L KH2PO4,350mg/L NaHCO3,8000mg/L NaCl,121mg/L Na2HPO4·12H2O,1000mg/L葡萄糖。
② 取1g重组胰蛋白酶(细胞培养级),用HBSS平衡盐溶液溶解澄清,使胰蛋白酶的酶活浓度为500USP units/ml-1500 USP units/ml,或者使胰蛋白酶的质量浓度为0.1mg/ml-0.3mg/ml。(500USP units/ml的浓度适合大部分细胞的消化,原代细胞、组织等可适当提高浓度至1500 USP units/ml)
注意事项
1)冀百康生物重组胰蛋白酶消化液含有EDTA,应注意其不同细胞的使用适配性。且本重组胰蛋白酶消化液不含抑菌剂,使用过程中要特别注意无菌操作,避免消化液被微生物污染。
2)建议将本重组胰蛋白酶消化液分装为100ml/瓶,在-15~-20℃条件下存放,能稳定存放12 个月。不宜 4℃长期保存,切忌反复冻融造成胰蛋白酶的活性降低,并可减少污染的机会。
常见问题
Q1:什么是EDTA?为什么重组胰蛋白酶要加入EDTA?
EDTA作用较胰蛋白酶缓和,主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2,这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散,因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用,效果较好。常用比例为1:1或者2份EDTA:1份胰蛋白酶。EDTA的工作液浓度为0.02%,用不含Ca2+、Mg2的BSS配置。如果使用EDTA,在终止消化前,需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。
Q2:如何控制胰酶消化时间?
不同细胞对消化液的敏感性不同,胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度,是否含EDTA,胰酶的储存时间,胰酶的储存温度,是否反复冻融,消化加入的胰酶体积,消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞,建议先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间,可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆,记录最.佳消化时间,下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。
Q3: 培养基误存于-20℃,溶解后继续使用?
在-20℃下,培养基中的盐容易析出,培养基再次融化后,有的盐可能无法重新溶解,从而导致培养基营养成分和渗透压改变,培养细胞时,容易细胞破裂而死亡,建议丢弃该培养基,使用新的培养基用于细胞培养。
Q4:消化过度的主要特征有哪些?
会导致相当一部分细胞损伤和死亡,刚传代后的培养液表面漂浮细胞团,肉眼可见漂着小片白色膜状物。如果细胞团中都是死细胞,则不会贴壁。如果细胞团中仍存在有活力的细胞,就会贴壁造成局部细胞密度不均匀,该局部较快形成中央坏死细胞区 。
Q5:细胞消化不下来是什么情况?
*参考文献1.Drexler HG, Uphoff CC. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 2002;39:75–90.
2.Merten O. Virus contaminations of cell cultures – A biotechnological view. Cytotechnology. 2002;39:91–116.
3.生物医学小坑https://picx.zhimg.com/80/v2-7229d60c7ce1e7c56a532394fp?source=1940ef5c.
众所周知,眼部皮肤是脸部最薄弱的部位,厚度仅为0.4mm,为了保证眼球的灵活转动,眼睛外的阻力就得小;而眼周皮肤仅有极少的皮脂腺、汗腺,因此眼部肌肤保护功能弱,加上眼部四周的水分容易蒸发,在保水能力不佳的情况下,眼周极容易干燥。同时,在长期熬夜、情绪波动大、眼疲劳、衰老等因素下,眼部皮肤的血管供血不足形成滞流,代谢废物堆积过多,造成眼部色素沉着,直接导致眼部的黑眼圈和浮肿。
作为常见的肌肤问题之一,除了改变个人的生活习惯和采取医美手段外,我们也可以通过使用眼部护理类的护肤品进行改善。据说“用最贵的眼霜熬最长的夜”是熬夜家族公开的秘密,康康我呀,跟别人可不一样,我是“选用最对的眼霜成分,熬最长的夜”。(并无不良引导,建议正常作息)
二肽-2是一种生物活性肽,常被称为“眼袋肽”。在护肤产品中被用于减轻眼部浮肿和黑眼圈。二肽-2被临床证明可以改善眼部弹性,强化血管,对抗眼部浮肿,经常用于眼霜中。
专利技术亮点:
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人体功效测试:
经实验证实,二肽-2能有效改善眼部水肿,是有效的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂,从而改善血液循环,减少浮肿。
*参考文献:1.Draw the Line on Wrinkles;2.Peptides And How They Work, with Kristina Kannada, Hydropeptide
乙酰基四肽-5是一种胶原蛋白合成促进剂,有助于皮肤的修复和再生,且可以刺激胶原蛋白的合成,从而改善眼部肌肤的弹性和紧致度,减少细纹和皱纹的出现。
功效:
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人体功效测试:
将添加10%的乙酰基四肽-5眼霜,应用于一组由20名年龄在25 ~55岁的志愿者中,每天早晚两次均匀涂抹于眼周;
# 使用四周后,55%的受试者眼袋有明显改善;
# 使用二个月后,85%受试者眼袋均有不同程度减轻;
功效:
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第三方功效检测:
添加2%的样品Gebiotide®俏眼复颜肽原液对弹性蛋白酶抑制率可达17.38%,表明其具有抗皱、紧致功效。
*数据来源:冀百康生物第三方测试报告
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