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紫杉烷是一类具有高价值药理活性的四环二萜化合物，包括紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛和各种紫杉烷骨架衍生物。其中，紫杉醇（taxol®）是一种著名的抗癌药物，但由于其复杂的合成过程和有限的产量，其获取一直具有挑战性。尽管数十年来科学家们已经阐明了紫杉醇的生物合成途径，但在特定的催化反应序列和异源合成能力方面，研究仍然有限。

图1 | 将MVA转化为紫杉醇的生化合成系统图

近日，中科院天工所刘晓楠、江会锋研究员团队于期刊Synthetic and Systems Biotechnology发表研究论文Biochemical synthesis of taxanes from mevalonate，针对紫杉醇生物合成中的第一个P450酶T5αOH的低催化效率和产物多样性问题，开发了一种生物和化学方法结合的人工合成系统，通过无细胞酶促反应、化学催化和全细胞催化的综合策略，成功地绕过了T5αOH和TAT步骤的瓶颈，优化了反应过程，并实现从甲羟戊酸（MVA）高效合成稀有紫杉醇中间体T5α-AC，进而转化为T5α-AC-10β-ol。这一成果为未来紫杉醇生物合成途径的理解和解码奠定了基础。

建立紫杉二烯无细胞合成体系

研究建立了一个以甲羟戊酸（MVA）为前体的体外紫杉二烯合成系统。该系统利用一系列酶，包括甲羟戊酸激酶（MK）、磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MVD）、异戊烯二磷酸异构酶（IDI）、二磷酸鸟苷焦磷酸合成酶（GGPPS）和截短的紫杉醇合成酶（TS），以促进紫杉二烯的合成。

图2 | 从MVA酶法合成紫杉二烯

在Tris-HCl缓冲液中，紫杉二烯的产量达到了0.22 mg/L，是磷酸盐缓冲液中的3.6倍。研究通过优化反应条件，如温度、pH和反应时间，使紫杉二烯的产量增加到了0.31 mg/L。此外，通过引入聚磷酸激酶（PPK）和焦磷酸（PPi）来再生ATP，进一步提高了产量。最终，通过替换酶和辅因子，实现了产量1.7倍的提升。

紫杉二烯合成体系的优化

研究将紫杉二烯途径分为两个部分（包括MK、PMK、MVD、PPK、IDI的第一部分和GGPPS、截短的TS的第二部分），并针对这两部分的酶量进行了优化。实验结果显示，第一部分酶装载量增加2倍，第二部分增加40倍，可分别使产量提高1.2倍和5.4倍。

为了提高从MVA到紫杉二烯的转化效率，研究人员筛选了六种不同来源的IDI，发现来自丹参的IDI活性最高。通过工程表达融合蛋白BST1-ERG20，促进IPP和DMAPP转化为GGPP，增加了紫杉二烯产量27%。同时，添加7 mM Na3VO4以抑制磷酸酶污染，进一步提高紫杉二烯产量69%。

图3 | 提高紫杉二烯的收率

进一步的优化包括测试七种酶的最合适浓度梯度，调整酶的摩尔比，并采用流动添加MVA策略，减少GGPP的积累，增强下游反应速率。通过这些策略，紫杉二烯的产量达到了44.3 mg/L。

为了增强体外系统的合成潜力，团队还测试了不同浓度的MVA，并引入了对GGPP抑制不敏感的甲烷古菌来源的MK酶，以及重新评估了PPK2CpaN和PPi的装载量，这些措施使得紫杉二烯产量进一步提高。

最终，通过监测系统的时间梯度，8小时内从17.5 mM MVA中合成了547.4 mg/L的紫杉二烯，转化率约为46%。通过精心调整酶的种类和数量，平衡整个途径的催化速率，确定了pH值为8.5是多酶级联反应最适宜的条件，最终优化的一锅式系统中紫杉二烯的产量达到了946.7 mg/L，转化率提高至79.6%。

化学酶法合成紫杉烷

通过化学酶系统合成紫杉烷类化合物，研究从MVA反应系统中提取并纯化紫杉二烯，用于后续的酶催化或化学合成T5α-AC。研究先尝试使用酶反应系统进行合成，但产量极低，后采用钯催化的乙酰氧化法成功合成了T5α-AC，产率达到48%。

图4 | 从紫杉二烯合成T5α-AC-10β-ol的化学与生物偶联

为了高效合成氧化紫杉烷类化合物，研究构建了一个以酿酒酵母为宿主的细胞工厂，使用化学合成的T5α-Ac作为底物。通过比较不同来源的T10βOH酶活性，并优化表达方式，成功将T5α-AC转化为T5α-AC-10β-ol，产量达到15.8 mg/L，为目前报道的最高产量。该系统可用于进一步的P450酶功能鉴定、生物合成途径分析和紫杉醇的异源生物合成。

本研究通过化学与生物方法的结合，成功提高了紫杉醇中间体的产量。研究中，通过优化体外反应系统，实现了紫杉二烯到T5α-AC-10β-ol的高效转化，并通过钯催化的乙酰氧化法替代了低效的酶催化步骤，显著提升了反应效率并减少了副产物生成。此外，通过在酿酒酵母中优化T10βOH-1的表达，进一步增强了对T5α-AC的利用能力，使得该混合系统相比传统生物合成途径产率提高了2000倍以上。这项工作不仅为紫杉醇的工业生产提供了新策略，也为合成生物学和植物天然产物的人工合成提供了宝贵的科学基础和应用前景。

文献来源：

[1] https://doi.org/10.1016/j.synbio.2024.05.002