评估生物制药中蛋白质聚集体和不溶性颗粒的考虑要点

       摘要：生物制药产品中的蛋白质聚集体和不溶性颗粒是可引起免疫原性的杂质。蛋白质聚集体和不溶性颗粒在制造和储存过程中形成，应对其进行表征以优化制造过程并建立控制策略。一直关注到有关这些颗粒的评估和控制的几个问题。然而，对于并行利用分析技术来建立此类蛋白质聚集体和不溶性颗粒的控制策略，其尺寸从几纳米到几百微米不等，仍未达成共识。因此，这项研究中通过问卷调查了日本生物制药公司，其中包括有关在各个开发阶段用于建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒控制策略的分析技术的问题。总结调查结果发现从早期开发和配方优化阶段到商业生产，尺寸排阻色谱、光遮光和目视检查一直被使用。除了光遮蔽法外，流动成像（FI）是亚可见光颗粒表征最常用的技术;因此，记录了使用FI建立控制策略。总结了基于药物开发生命周期建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒控制策略的建议。

       【NO.1】介绍

       生物制药原料药（DS）和药品（DP）中的蛋白质聚集体和不溶性颗粒被认为是需要充分评估和控制的杂质，因为它们可能引发免疫原性。这些杂质的表征对于建立控制策略非常重要。应同时使用多种分析技术，以获得生物制药中蛋白质聚集体和不溶性颗粒的全部特性，其尺寸从几纳米到数百微米不等。因为每种分析方法具有不同的分析性能和特征，例如直径度量（费雷特直径、等效圆直径和流体动力学直径等）、测量直径范围、定量或定性以及药典或非药典的差异。此外，聚集体和不溶性颗粒水平所需的分析性能和特性可能因从早期开发到商业生产的生命周期阶段而异。因此，预计分析技术将分阶段应用来评估和控制产品中的蛋白质聚集体和不溶性颗粒。此外，在制造过程和储存过程中出现或形成的蛋白质聚集体和不溶性颗粒可能在形态和来源上表现出明显的特征。不溶性颗粒按其来源分为三类：

       （1）外源性颗粒是外来材料，预计不会出现在制造过程中;

       （2）源自制造过程和初级容器的本征颗粒;

       （3）制造仪器和蛋白质颗粒的预期固有颗粒。

       蛋白质聚集体可分为解离或不可逆，或天然或变性状态。蛋白质聚集体和不溶性颗粒的这些表征有望用于风险评估。它们可用于建立控制策略，例如识别引发聚集体形成的因素和选择制造工艺以减少蛋白质聚集体和不溶性颗粒。

       然而，对于并行使用多种分析技术来建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒的控制策略，目前尚未达成共识。因此，各个公司必须考虑应将哪些类型的分析技术组合为分析策略，并应制定制造过程中蛋白质聚集体和不溶性颗粒的控制策略。基于这种情况，有必要就聚集体和不溶性颗粒的控制策略组织共识。

       在这项研究中调查了日本生物制药公司，这些公司同时使用多种分析技术来建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒在其开发和生命周期的不同阶段的控制策略。根据从参与机构收集的调查结果，该小组讨论了使用FI来建立控制策略。该小组还总结了在为蛋白质聚集体和不溶性颗粒制定控制策略时需要考虑的要点。

       【NO.2】调查结果讨论

       使用了某些分析技术，例如SEC、LO和FI，而其他技术则未使用。对于集成技术，如DLS、SLS和LD，一些大颗粒会影响粒度分布，并且很难将测量信号与前面讨论的颗粒浓度定量关联起来。对于单颗粒技术，如电感应区（ESZ）、NTA和RMM，可以适当测量的浓度范围很窄，并且实际测量的体积与制剂的总体积相比很小，导致统计采样不足。关于NTA和RMM，基于对商业蛋白质产品中亚微米颗粒水平的多公司评估，报告了实验室间的显著差异。此外，从这些技术获得的结果很难解释。也很难在这些结果与SEC、LO和FI的结果之间建立明确的相关性。这可能会使建立可见和不可见颗粒的控制策略变得困难。为了解决这些问题，有必要开发能够以高精度、精密度和更宽动态范围定量测量亚微米范围颗粒的技术，并开发一种将结果与SEC、LO和FI联系起来的定量模型。

       【NO.3】建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒控制策略的注意事项

       为了对使用多种分析技术建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒的控制策略达成共识，我们的建议总结如下。它从介绍性部分开始，然后是选择每个阶段要使用的分析技术并根据开发阶段建立控制策略的指南。如上所述，从讨论中摘录了使用FI的考虑要点。还参考了当前的行业观点、监管指南和药典，总结了关于可见颗粒控制的建议。

       使用基于风险的方法建立控制聚集体和不溶性颗粒的策略，以确保产品的安全性、有效性和免疫原性（图4）。风险评估以开发过程中获得的知识为依据，包括聚集体和不溶性颗粒的综合表征。建议使用各种分析技术来全面表征蛋白质聚集体和不溶性颗粒。正交技术有助于评估颗粒性质（外源、内征或内在）、颗粒数量、颗粒粒度分布以及区分颗粒的其他特性。了解蛋白质聚集体和不溶性颗粒的特性可用于确定潜在的形成机制。这些知识还可用于指导配方或制造工艺开发过程中的配方和工艺参数的选择，从而减少最终药品中的蛋白质聚集体和不溶性颗粒。

       图4 通过基于风险的方法建立聚集体和不溶性颗粒控制策略的计划

       3.1 开发阶段（第1-3期）

       SEC、LO和目视检查等常用分析技术用于临床试验中使用的原料药和产品的放行或稳定性测试。如果需要，FI可用于产品的脱模或稳定性。对于原料药的额外监测和表征，可以使用使用MALS作为SEC检测器的SEC-MALS、AUC和DLS。FI可用于药品的额外监测和表征。LO和FI用于监测和分析>10μm和<10μm颗粒的特性。

       应考虑使用其他技术来解决随着开发进程而出现的问题。例如，qLD、NTA、RMM、ESZ、静态光散射（SLS）、LM、BMI、FT-IR和拉曼光谱等技术可能有助于了解聚集体和不溶性颗粒，包括亚可见和可见颗粒的数量和分布、它们的来源以及与制造过程的相关性。更先进的分析技术，如全息视频显微镜或机器学习工具，可以用作SEC、LO和FI的正交技术。使用多种技术，可以阐明聚集体和颗粒形成背后的因素和机制，例如在填充过程中从泵产生的金属颗粒充当聚集体形成的核，以及用作表面活性剂的泊洛沙姆的材料属性（疏水性）参与可见颗粒的形成。因此，通过结合多种技术获得的信息最终将有助于建立风险缓解措施，以减少制造过程中颗粒的产生。当难以评估发育过程中检测到的蛋白质聚集体和不溶性颗粒的安全风险时，除了颗粒组成、尺寸分布和数量的分析结果外，生物活性（例如体外免疫细胞活化）的评估可能为建立控制策略提供有用的信息。

       3.2 配方开发和使用中/相容性研究

       为了灵敏地检测配方的差异和应力引起的变化，与其他步骤相比，评估<10μm颗粒更为重要。特别是，在检查配方时，选择能够以高通量分析少量样品的技术或仪器。除了SEC、LO和FI之外，DLS是另一种用于配方开发的技术。qLD、NTA、RMM、SLS和BMI也可用于评估亚微米到亚可见的颗粒。虽然不包括在问卷中，但浊度和粘度被用作配方开发的指标。

       3.3 商业生产

       放行和稳定性测试需要成熟、授权且符合法规的技术或程序。作为这些测试的一部分，使用SEC测试原料药的纯度。对于药品，除了SEC之外，还通过LO进行目视检查和不可见颗粒测试。控制策略还包括对开发过程中确定的相关原材料（添加剂，如表面活性剂和容器密封系统）和制造工艺参数（原料药的病毒灭活和纯化过程以及药品的灌装过程）的控制。此外，在监测原料药或药品的聚集体和不溶性颗粒时，应建立行动限值，以表明是否需要进一步研究。对于可能在开发过程中或商业生产开始后进行的可比性研究，如上所述，SEC、LO和目视检查将是基础，也使用FI和DLS。

       3.4 根本原因分析

       如果在目视检查过程中检测到可见颗粒，则应进行根本原因分析。为了进行根本原因分析，应确定颗粒中的元素，并立即确定颗粒来源。常用的技术包括FT-IR、拉曼显微镜、EM和电子显微镜能量色散X射线（EM-EDX）。

       3.5 利用FI建立控制策略

       FI提供有关亚可见颗粒的数量（浓度）及其形态参数的信息。因此，它用于定量和定性评估不可见颗粒。考虑到这些特性，FI可用于早期开发期间或1-3阶段的配方开发、稳定性测试和监测。当检测到颗粒数量突然增加等趋势时，FI也可用于确定原因或故障排除，例如，通过从形态参数推断颗粒增加的来源（蛋白质颗粒、硅油或空气）。此外，所得颗粒图像可用于结合机器学习来估计导致蛋白质聚集体和不溶性颗粒的制造过程或应力类型。

       一般药典测试方法（USP788、787、Ph.Eur.2.9.19、JP6.07、6.17）中未包含FI，并且存在轻微的稳定性问题。因此，它们通常不用作商业生产中的放行或稳定性测试。确定开发过程中特性测试的结果（包括FI）与放行测试结果（如LO）之间的相关性，可能有助于制定合理的控制策略。例如，如果在开发阶段同时使用LO和FI的批次分析结果是相关的，则在商业生产中可能仅使用LO来捕获趋势。但是，如果FI可以检测到LO无法捕获的波动，那么在商业生产中应用FI进行监测可能是一种有效的降低风险措施。

       3.6 可见粒子控制的注意事项

       由于可见颗粒的无意污染可能会被召回，因此有必要制定控制策略以最大限度地减少可见颗粒的发生和影响。除了根据GMP进行环境控制外，产品和制造工艺的适当设计也很重要。在整个制造过程中控制可见颗粒包括建立包装材料的验收标准、制备药物溶液、灌装作、对灌装产品进行100%检查以及最终决定运输。此外，应考虑目视检查的生命周期，包括检查资格、检查员培训、缺陷表征以及通过趋势分析进行持续改进。

       目视检查从填充后的100%检查开始。应设置代表性拒绝率限值，以识别不符合标准的批次。可以为每个缺陷类别（关键、主要和次要）和可见粒子源设置限值。经过100%检查后，应从检验员判断适合目视检查的容器中选择统计上合理的样品数量。样本量和缺陷容器的数量可以根据AQL确定。通常，分别为高风险和低风险缺陷设置低（严格）和高（宽松）AQL。一旦超过检验限值或AQL允许的缺陷数量，应启动调查。调查可能包括重新测试、识别和表征检测到的可见颗粒，以及根本原因分析。

       可以根据患者影响的风险和法规遵从性对缺陷进行分类。严重缺陷可能导致患者发生严重不良事件或死亡，例如与无菌产品的容器完整性不相容导致微生物污染的风险。重大缺陷存在暂时性产品故障或医学上可逆反应的风险，但引起严重副作用的可能性很小。轻微缺陷不会影响产品性能或合规性，而只影响产品的外观。

       根据它们的来源，可见粒子可以分为外源、内在或内在。外源性颗粒源于正常的制造过程之外。在为外源性颗粒设定限值时，应考虑外源性颗粒含量高的批次可能造成较高的微生物污染风险，并表明缺乏GMP控制。由于本征颗粒来自制造过程中使用的原材料、设备和内包装，因此应在早期开发阶段确定其原因，并采取措施防止产品有缺陷。由于本征颗粒包括蛋白质颗粒和来自最终药品的其他颗粒，因此在开发过程中应评估批次内的颗粒分布。

       在检查过程中，可靠地去除了带有外源性和内源性颗粒的容器，原则上也应去除内在颗粒。但是，如果满足商品外观规格，该测试可能会允许接受固有颗粒。此外，内源性颗粒（如硅油液滴和蛋白质颗粒）可能允许出现在可检测到的产品中。是否应允许可见颗粒必须根据其识别和表征、导致其发生的因素的调查以及安全风险评估来确定。如果测试允许可见颗粒，则必须制定控制策略，包括释放测试，以控制可见颗粒。可以可靠测定的颗粒大小取决于配方、容器和颗粒特性。建议准备适当的标准品和限量样品，并使用它们来培训检查员区分可接受和有缺陷的单位容器。此外，在稳定性测试期间，应监测任何可能随时间产生大于可接受标准的颗粒或数量大于验收标准的颗粒的变化。

       【NO.4】结论

       根据调查结果，本文讨论了评估和控制聚集体和不溶性颗粒的方法。SEC、LO和目视检查从早期开发和配方考虑到商业生产都得到一致使用。除了这些分析方法外，FI是亚可见颗粒表征最常用的技术。然而，由于在日本批准的大多数生物制药都是许可产品，很少有产品是独立开发的，因此关于如何利用FI存在各种想法。因此，本研究建立了目前对使用FI建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒控制策略的理解。随着技术的进步，需要进一步的研究和讨论来构建新的方法。在商业制造中，当在目视检查过程中检测到颗粒时，需要进行根本原因分析。然而，许多公司将检测到的颗粒物的鉴定外包出去，需要注意的技术要点可能不会在相关方之间共享。尽管蛋白质聚集体和不溶性颗粒的表征有助于质量控制策略的开发，但无法定量评估亚微米颗粒（从大约100nm到1μm）被认为是分析技术面临的挑战。更先进技术的开发和应用可能会解决这些挑战。此外，应确保新分析技术的有效性以促进其使用。除了开发新技术和改进设备外，还需要开展促进测量协议标准化的合作活动，包括应用新的参考物质，这将是有效的。

       除了调查结果外，关于建立蛋白质聚集体和不溶性颗粒控制策略的建议也总结在要考虑的要点部分中。全球尚无全面解决蛋白质聚集体和不溶性颗粒问题的监管指南。我们希望我们的建议将有助于促进其他生物制药的发展并确保其质量和安全。