人类诺如病毒及其小分子抑制剂研究进展

       人类诺如病毒（Human norovirus，HuNoV），也被称为诺瓦克病毒，是全球急性胃肠炎的主要原因之一。HuNoV影响所有年龄组，具有高度传染性，特别是免疫系统较弱的人群，并可能导致严重的临床后果。由于 HuNoV 具有遗传变异大、进化快的特点，这给抗病毒药物的研发造成了极大挑战。在全球范围内，大多数胃肠炎病例是由大流行性 GII.4 人类诺如病毒（HuNoV）毒株引起的。据估计，诺如病毒每年导致约 6.84 亿人患病，约 21.2 万人死亡。卫生系统和社会直接成本每年超过600 亿美元。作为一种传染性极强的肠道病原体，其对全球公共卫生造成重大威胁，引起了国际上的广泛关注。目前，还没有批准的疫苗和针对 HuNoV 的特异性治疗方法。

       诺如病毒（Norovirus，NoV）是无包膜的单股正链 RNA 病毒。HuNoV的RNA 基因组长约 7.7 kb，其基因组由三个开放阅读框（ORF）组成：ORF1 编码一个多聚蛋白，该蛋白被病毒蛋白酶裂解为六个非结构蛋白，其中包括 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp），这是一种促进病毒 RNA 复制的关键酶；ORF2 编码主要衣壳蛋白 VP1，该蛋白结构上分为S和 P区两个相邻的区域，其中 S区形成内核，构成 VP1 的底座；P 区形成拱样结构突出于内核外，可进一步分为 P1和P2亚结构域；ORF3 编码次要衣壳蛋白VP2，VP2具有稳定病毒颗粒的作用。根据VP1 的氨基酸序列，NoV 被分类为至少10个基因组（GI-GX），这些基因组进一步细分为49个基因型。在可感染人类的五种基因组（GI、GII、GIV、GVIII和GIX）中，GI 和GII 突变体是导致肠胃炎病例的主要病原体。特别是 GII.4 基因型长期以来一直是全球胃肠炎暴发的主要原因，其变体每隔 2-4 年就会进化成新的变体，因其高传染性和引发大规模流行病的能力而闻名。

       NoV基因组测序有助于开发基于核酸的NoV 检测方法。20世纪90年代中期，第一个以 ORF1 中RNA 聚合酶基因相对保守区为靶点的 RT-PCR 被用于检测 NoV。此后，针对 NoV开发了更多实时、快速和灵敏的分子检测方法，包括 RT-qPCR、微滴数字 RT-PCR、多重 RT-PCR、巢式 PCR、高通量测序基因芯片、逆转录环介导等温扩增法等。通过靶向检测ORF1-ORF2 连接处的保守基因组区域，发现基于实时核酸的方法比抗原检测分析更灵敏、更具广泛的反应性。普通 RT-PCR 在电泳过程中易交叉污染。多重 RT-PCR 虽然具有同时检测多种目标分子的优点，但容易发生非特异性扩增。巢式 PCR 无法对病毒定量，耗时长且容易发生交叉污染。近年来，普通 RT-PCR、多重 RT-PCR 等逐步被新方法取代。

       诺如病毒小分子抑制剂

       人类诺如病毒抗病毒药物早期研究的进展缓慢，很大程度上是由于其细胞培养系统的建立困难。直到2016 年，人类诺如病毒在源自干细胞的人肠上皮细胞（human intestinal enteroids, HIEs）中的培养系统才初步建立，但 HIEs 系统中的病毒复制量仅为670倍，其有限的病毒复制量仍是研究疫苗和药物的障碍（诺如病毒在B细胞系中的复制量更低）。此外，人类诺如病毒具有物种特异性，无法感染其他物种。此前对人类诺如病毒的认知主要基于其他杯状病毒研究，例如通过鼠诺如病毒在细胞培养和小鼠模型中筛选潜在抗病毒药物。在肠道类器官培养模型中筛选诺如病毒抑制剂成为开发慢性感染治疗的新策略，许多广谱抗病毒药物已在实验中表现出对诺如病毒的抑制活性。

       1、RNA 聚合酶抑制剂

       HuNoV的RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）在病毒基因组的转录和复制中发挥至关重要的作用，成为抗病毒治疗的重要靶点。RdRp是一种用于病毒复制的酶，在RNA 病毒中高度保守，且在哺乳动物细胞中无同源蛋白，是抗病毒药物研究的重要靶点。HuNoV 的RdRp 结构类似于其他正链 RNA 病毒，具有右手型结构，包括手指、手掌和拇指子结构域，以及连接手指和拇指的 N端结构域。手指和拇指子结构域协作包围手状结构，形成单链模板 RNA 的通道。

       ①核苷类抑制剂

       RNA依赖性RNA 聚合酶（RdRp）是治疗诺如病毒感染的重要靶点。核苷类抑制剂（nucleoside inhibitors, NIs）作为底物类似物，通过竞争性抑制终止 RNA 合成，通常表现出广谱抗病毒活性。目前发现，针对其他 RNA 病毒开发的核苷抑制剂也可用于诺如病毒感染治疗。

       法匹拉韦（favipiravir, T-705）是一种前药，在体内快速转化为法匹拉韦三磷酸，通过竞争性抑制病毒复制转录并诱发致命突变。该药物已在部分国家广泛用于流感治疗，并在埃博拉病毒、COVID-19及拉沙热的治疗中发挥作用。法匹拉韦作为嘌呤类似物，可抑制人类诺如病毒复制子。实验表明其对鼠诺如病毒具有疗效，在小鼠模型中通过抗病毒诱变降低病毒载量，并观察到突变频率增加及病毒 RNA 传染性降低。然而，法匹拉韦可能在小鼠和患者体内诱导诱变，用于慢性诺如病毒感染存在潜在风险。

       利巴韦林（ribavirin）是广谱抗病毒药物，对DNA和RNA病毒均有效，临床用于呼吸道合胞病毒、流感、拉沙热、肝炎及麻疹治疗。利巴韦林通过抑制RdRp发挥作用，对鼠诺如病毒抑制效果显著，是当前治疗诺如病毒感染的主要药物，尤其在原发性免疫缺陷患者的慢性感染中疗效显著。但其与硝唑尼特联用效果存在争议，部分临床数据显示疗效欠佳

       2′-FdC（2′-fluoro-2′-deoxycytidine）是核苷类似物，其通过转化为 2′-FdC-三磷酸（FdCTP）并入细胞 DNA/RNA，抑制病毒复制，对HCV、拉沙病毒及克里米亚-刚果出血热病毒等均有效。研究发现，在RAW264.7小鼠巨噬细胞模型中，2′-FdC 能有效抑制鼠诺如病毒传播。能够显著降低 RAW264.7 细胞中 MNV-1 的病毒RNA和NS1/2 蛋白表达。使用 100 μmol·L-1的 2′-FdC 处理后，诺如病毒滴度降低，其抑制 MNV-1 复制的 IC50 值为 20.92 μmol·L-1，RAW264.7 细胞中 2′-FdC 的CC50 值为 1.768 mmol·L-1。为进一步验证 2′-FdC 的功效，研究人员测试了急性清除菌株 MNVCW3 和持续性菌株 MNVCR6，结果显示 2′-FdC 同样能抑制两种病毒株的 RNA 复制及蛋白表达。

       2′-C-甲基胞苷（2′-C-methylcytidine, 2CMC）最初作为抗 HCV 药物开发，但其前药 Valopicitabine 因胃肠道副作用终止临床研究。然而，2CMC仍被报道为潜在抗诺如病毒药物。研究表明，2CMC 可抑制鼠诺如病毒形成及RNA合成，并在小鼠模型中减少病毒脱落及传播。在人类诺如病毒 BJAB 细胞培养系统中，2CMC的EC50值为0.3 μmol·L-1。研究人员评估了2CMC衍生物，如2FCMC、N-羟基胞苷NHC的活性。在 RAW264.7 细胞中，2CMC 和2FCMC 的EC50 分别为 6.9 μmol·L-1和 12.7 μmol·L-1，而 NHC 和拉米夫定无显著抑制。在 HG23 细胞中，2CMC、NHC和2FCMC的EC50分别为1.3 μmol·L-1、1.5 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1。目前研究聚焦于开发更安全的 2CMC 衍生物。

       4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪核苷衍生物具有显著抗诺如病毒活性。其通过修饰糖基和碱基获得系列衍生物，其EC50为0.007~11 μmol·L-1，CC50 为0.01~23.7 μmol·L-1。尽管存在细胞毒性，但其双重抗小鼠和人类诺如病毒活性为后续优化提供了基础。

       NCT（5-硝基胞苷三磷酸）最初作为抗脊髓灰质炎病毒药物被发现，其抑制 RdRp活性优于利巴韦林。过X射线晶体学测定了诺如病毒聚合酶与NCT结合的高分辨率结构。该结构显示，RdRp被包裹在一个包含互补引物模板RNA和两个金属离子的三元复合物中。NCT分子占据核苷酸结合位点，通过竞争性抑制导致RNA链终止，但其抑制诺瓦克病毒复制的潜力仍需更多实验验证。

       ②非核苷类抑制剂

       非核苷类抑制剂（non-nucleoside inhibitors, NNIs）通过与RdRp变构位点结合，终止复制所需的构象变化。目前NNIs主要针对HCV或HIV开发，尚无专门针对人类诺如病毒的上市药物。

       苏拉明（suramin）通过脂质体递送可抑制鼠诺如病毒复制，但其临床应用受限于药代动力学和毒性问题。其衍生物PPNDS最初作为P2X1受体激动剂，后证实对人诺如病毒和MNV RdRp具有强效抑制。PPNDS通过结合RdRp的NAF2位点广泛抑制转录活性。在10 μmol·L-1浓度下，PPNDS对猫诺如病毒聚合酶的IC50达2.7 μmol·L-1。然而，苏拉明及PPNDS因细胞通透性差和非特异性脱靶活性，需进一步优化以克服研发障碍。

       近年研究发现，HCV NNIs如JTK-109可通过结合Thumb I位点（Q414和R419）抑制杯状病毒科，如诺如病毒属、沙波病毒属和拉戈病毒属等6个RdRp的转录活性，其抑制诺如病毒RdRp的IC50为4.3~16.6 μmol·L-1。

       NIC02、NIC04、NIC10和NIC12化合物也是潜在的药物支架。通过GTP掺入法动力学研究发现，NIC02和NIC04可同时结合游离酶及酶-底物复合物。而NIC10和NIC12只与酶-底物复合物结合，因此可能与底物结合位点不同的变构口袋结合，所以NIC02和NIC04、NIC10和NIC12在诺如病毒RdRp中可能占据不同的结合位点。

       2、3C样蛋白酶抑制剂

       诺如病毒3C样蛋白酶（3CLpro）是一种半胱氨酸蛋白酶，其核心结构与胰凝乳蛋白酶类似，由N端反平行β折叠和C端β桶结构域组成。活性位点位于两结构域间裂口处，催化三联体（Cys139、His30、Glu54）特异性识别P1 Gln残基，负责病毒多蛋白裂解，生成结构与非结构蛋白。因此，3CLpro是抗诺如病毒药物设计的重要靶点。

       芦平曲韦（rupintrivir）最初针对人类鼻病毒3CLpro开发，近期研究显示其可抑制人类诺如病毒3CLpro，EC50为（0.3 ± 0.1）μmol·L-1，EC90为（1.5 ± 0.2）μmol·L-1。但A105V和I109V突变可降低病毒对芦平曲韦的敏感性，耐药机制尚不明确。

       GC376 等一系列 3CLpro 过渡态抑制剂。过渡态类似物竞争性抑制剂在分子结构上与底物相似，在酶促反应中，抑制剂和底物竞争与酶的活性中心结合。过渡态抑制剂目前可分为两类，一类是肽基化合物（如 GC376），研究人员利用诺如病毒蛋白酶在谷氨酰胺-甘氨酸肽位点裂解的特点，通过谷氨酰胺替代物发挥抑制作用。基于此结构开发的一系列变体均显示出高水平抗病毒活性。另一类是大环化合物，作为肽基抑制剂的结构修饰版本，旨在提高膜透性和口服生物利用度以增强临床适用性。尽管其效果不及肽基抑制剂，但表现出对 RNA 病毒的广谱抗病毒活性。

       3、未知作用靶点药物

       硝唑尼特（nitazoxanide, NTZ）最初作为抗寄生虫药物开发，后证实具有广谱抗病毒活性，临床用于流感及诺如病毒感染治疗。硝唑尼特作为新型药物的支架参与病毒复制的宿主调节过程。硝唑尼特生物利用度高且十分安全，具有丰富的上市后经验，超过7500万成人和儿童服用过此药物。而目前有多项临床实验表明，硝唑尼特对于治疗诺如病毒感染具有显著疗效。目前，其新型制剂正在进行全球III期临床试验，可抑制轮状病毒、冠状病毒、登革热病毒等多种RNA/DNA病毒。

       参考资料

       [1]刘阳.靶向人类诺如病毒RdRp的小分子抑制剂的发现及生物活性评价[D].浙江中医药大学,2024.

       [2]普春敏,陈丽丽,索玉娟,等.食品中诺如病毒的分离、富集与分子检测技术研究进展[J].上海农业学报,2024,40(05):131-141.

       [3]孙睿阳,刘永祥,钟武.小分子诺如病毒抑制剂的研究进展[J].沈阳药科大学学报,2023,40(12):1656-1665.

       作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。